抗生素研发中无菌验证检查法的问题与对策

审评三部邢俊生＊蒋煜

邢俊生＊山西省药检所
摘要：随着我国药品卫生学不断完善和贯彻执行，以及中国药典2005年版的执行，多数申请人在该无菌检查以及无菌验证工作中逐渐规范，但仍有部分存在一些问题。本文针对在无菌检查研究和整理申报资料过程中常见问题进行了分析，希望引起研发部门进一步重视对无菌检查和无菌验证工作。

一、概述
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。中国药典进一步说明如果供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。由此可见，无菌检查法的试验环境、试验器具、无菌检查方法以及样品三方面因素共同决定了该项检查结果是否真实可信，并能否反映产品的真实情况。
我国药品卫生学不断完善和贯彻执行，促进了我国药品质量不断提高。相比中国药典2000年版，2005年版药典对无菌检查的环境要求更一步明确，对单向流空气区、工作台面以及环境要求洁净度验证之外，尚要求对隔离系统进行验证。虽然无菌检查法已经比较成熟，但是由于该方法的特点，以及检验过程中可能导致污染的原因复杂，使无菌检查法在规范化以及标准化等方面仍有进一步发展的空间。另外，注射剂、滴眼剂、外用药剂型、处方工艺设计、辅料使用、无菌生产控制，以及无菌检查等仍是研究者必须面临的问题，因此也必须更关注该检查项目。
通过在审评中心半年的学习，并结合日常在省药检所的实际工作，认为在中国药典2005年版执行两年多，多数企业在该无菌检查以及无菌验证工作中逐渐规范，但仍有部分生产企业存在一些问题，值得探讨：
二、无菌检查的现状
1、多数生产企业的常规工作量大，部分企业相对缺少标准化试验用仪器，微生物专业人才。对检验人员的要求缺少统一的管理，操作没有规范的要求。中检所已经编印了《中国药品检验标准操作规范》2000年版，从仪器、设备、用具、试液、培养基、对照用菌液、抑细菌和抑真菌、检查法，结果判定等方面对无菌检查的要求和操作要领进行了规范化描述，但是部分申请人未严格执行，应加以注意。
2、检验方法本身的问题、可操作性差、检验结果不科学严谨。薄膜过滤法、直接接种法各自均有一定优缺点，需要在今后的过程中不断完善和改进，直接接种法可操作性差，在实践中引入污染的分险大，需要对环境以及人为操作等因素进行严格控制。
3、检验方法的验证、工作系统验证方法的尚需进一步完善，无菌检查方法的应用，可以考虑有无必要针对品种的不同特点逐步建立各药物的、可控的，具体操作的试验规范。
三、无菌检查研究中存在的主要问题
1、无菌检查法的试验环境
在试验过程中忽视了对无菌环境参数进行验证，或者忽视了应用标准化试验操作对试验环境进行验证，并积累验证数据。
2、试验器具、设备
1）培养基、稀释剂
由于目前的规范尚缺少对培养基的相关验证要求，对培养基的使用多为按标签上的浓度进行配制，进行灵敏度检查后再作为无菌检查使用。实际上无菌检查出现在培养基上的问题也不少，应引起足够重视。由于不同批次培养基的配料以及浓度的差别，和实际操作人员的不同，可能造成相同稀释倍数的培养基实际浓度不同，粘稠程度不同，以及酸碱度的不同，有时在对某些产品效价的测定过程中会造成较大误差。应对不同浓度培养基的灵敏度和浓度进行验证，确保在某个浓度范围内培养基对试验数据的支持。
药典纳入了两种稀释剂，不同稀释剂针对不同品种的适应性不同，但是目前在对稀释剂的选择和操作过程中尚没有要求进行验证。试验中需要对稀释剂和冲洗液的使用进行必要的验证，确保稀释剂和冲洗液的使用对样品中可能存在细菌和霉菌的相适应性和提供适宜的冲洗液用量，确保在试验中能够准确的获得需要的结果。
中国药典纳入了培养基、稀释剂的灭菌程序，目前多作为常规操作，可考虑根据每个品种的不同特性进行验证，选择提供明确的保证试验结果的培养基浓度、稀释剂类型，以及相适应的操作规范。
2）试验菌
部分申请人在研究过程中对培养基灵敏度检查和验证用的菌株验证结论试验理论不充分。试验用菌种的来源依据不充分，对菌种的使用不能进行科学有效的管理，导致无菌验证工作的失败和数据的不可靠性，应引起足够重视。
3、样品因素
某些情况下，容易出现假阴性和假阳性现象，部分申请人不做深入研究和比较。比如：在培养过程中如果温度控制出现问题会造成在培养期内细菌生长的变化，应该进行必要的验证和评价。由于操作者消毒灭菌不彻底或操作失误造成污染的风险也应进行了分析和研究。
4、申报资料整理中无菌检查法常见问题：
对检验方法的验证、培养时间的选择和结果判断缺乏系统的评价，应在验证资料中针对检查方法进行比较后说明所选择方法的合理性；并且对不同培养时间和培养温度湿度的观察记录后对细菌的影响，来确定具体的培养时间；最好对不同试验条件进行比较研究。
对样品检验数量和不同类型供试品的处理方式以及接种方法选择的验证没有完整的评述；中国药典提供了无菌检查每批地取样量，但是当进行验证时，应针对具体的品种取不同数量的样品进行验证比较，这样验证资料才能全面完整，针对不同类型的品种无菌检查的处理方式不同，需特殊处理的样品应进行比较试验进行验证。
在试验中对稀释剂和冲洗液的选择和用量需要进行试验比较，确定冲洗量及其他关键操作步骤。但在申报资料中对上述内容没有相应的论述。
做出验证结果的判断时缺少具体的试验数据进行表述说明。很多验证资料的结论仅仅是一个试验的结论，应针对验证的步骤和试验记录中出现的问题进行讨论，经分析比较论证后再确定验证使用的方法。
四、无菌检查和验证方法
无菌检查法包括：薄膜过滤法、直接接种法。需结合供试品情况选择合适的方法，并选择敏感菌株对供试品抗菌活性去除效果进行检验。制定出该品种的标准检验操作规程，明确样品在前处理过程中的处理步骤、采用的具体方法，以及各个环节的操作关键。制定标准的技术文件。
抗菌药品无菌检查的关键要素包括：1、去除抗菌活性，减少药物对微生物生长的影响。2、阳性菌的生长作为参考依据。
采取的解决措施，以及对冲洗条件的改善，β-内酰胺类抗生素使用β-内酰胺酶中和，其他抗生素改善冲洗条件试验，头孢类抗生素采用400ML稀释液溶解，冲洗采用0.1%蛋白胨溶液，以下为几种头孢类抗生素以及验证用菌株的适宜冲洗试验用量的参考：

由于卫生学检查的复杂性和多样性，由此导致了试验结果的不确定性。同时无菌检查为一次性的报告方式，因此为确保试验过程规范性和试验结果的真实性，对方法进行验证显得尤为重要。无菌检查验证内容包括：无菌环境的验证、灭菌器的验证、培养基灵敏度的验证、阴性对照、阳性对照等方面的验证工作。验证贯穿试验的整过程。上述过程可避免因阳性菌选择不合理、方法不合适等因素造成的试验不科学，数据不可信等现象。
验证工作需要考虑供试品自身带来的影响、方法有效性，操作过程的合理性等因素，例如：对于控制菌，在对为消除供试品的抑菌作用所采用中和法、离心沉淀法、薄膜过滤法等方法时进行验证，应进行对比研究，并要考虑整个试验过程的连贯性以及对前后过程衔接的影响。供试品中抗菌活性的去除以及供试品对微生物生长的影响也是验证的重点。
五、对无菌检查验证工作的建议
考虑到微生物限度和无菌检查的复杂性和多样性，以及检查方法的不断创新和改善，在试验过程中需结合供试品情况选择合适的方法，选择敏感菌株对供试品抗菌活性去除效果进行检验。制定出该品种的标准检验操作规程，明确样品在前处理过程中的处理步骤、采用的具体方法，以及各个环节的操作，制定标准的技术文件。
生产企业需要建立无菌微生物检查的长效培训机制，建立培训和管理机制，不断培训和了解当前检验方法。建立质量保证体系包括人员、试验室条件和管理，检验方法的规范化；标准菌株的使用和管理，试验菌液的制备的规范，需要建立规范化的研究体系。建立微生物学检验研究标准化的平台非常重要。生产企业在进行无菌验证的过程中应逐步完善对验证方法的研究，采用有效的手段不同的方法和试验条件进行比较，丰富验证的内容，提高验证技术水平。

本文仅代表个人观点，不代表审评中心最终观点。欢迎有兴趣同仁进行讨论。

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