关于低分子肝素类药品药学审评的思考

审评四部赵慧玲

低分子肝素（low molecular weight heparin，简称LMWH）是近十几年发展起来的新一代肝素类抗血栓药物，LMWH的抗血栓作用优于肝素，而抗凝血作用低于肝素，目前已广泛用于临床。
由于低分子肝素为生化药，其多糖链组成复杂，不能沿用一般化学药的研究思路。下面我将根据在审评工作中发现的一些共性的问题，对研发低分子肝素类药品工作提几点建议。
一、背景
欧洲药典2000年版和英国药典2002年版收载了5种LMWH，分别是达肝素钠（Dalteparin sodium）、依诺肝素钠（Enoxaparin sodium）、纳肝素钙（Nadroparin calcium）、帕肝素钠（Parnaparin sodium）和汀肝素钠（Tinzaparin sodium）。欧洲药典和英国药典对低分子肝素的定义是：低分子肝素是硫酸化聚氨基葡萄糖盐的混合物，重均分子量小于8000，其中至少60%（按重均分子量计）的分子量小于8000。多糖链的还原端和非还原端具有不同的化学结构。按干燥品计算，抗Ⅹa因子活性应不低于70IU/mg，抗Ⅹa因子与抗Ⅱa因子活性比应不不低于1.5。
由于我国申报的低分子肝素没有分级，基本上只能满足两个条件，重均分子量小于8000和抗Ⅹa因子活性应不低于70IU/mg、抗Ⅹa因子与抗Ⅱa因子活性比应不不低于1.5，且新药标准（试行）均未转正，不能仿制。
而我国进口的低分子肝素制剂包括了低分子肝素钠或钙注射液、纳肝素钙注射液、依诺肝素钠注射液、达肝素钠注射液、帕肝素钠注射液。按现法规，仿制上述制剂，应为化药注册分类6类。由于上述制剂的原料药在我国未上市，仿制上述制剂的原料应属化药注册分类3.1类。
二、制备工艺：
通常制备LMWH的原料药为肝素，肝素分子量在3 000～30 000D之间。LMWH是分子量约为5 000D（3 000-8 000D）的小分子。批量制备应满足以下5 个条件： ①平均分子量适宜；② 抗FⅩa活性与抗Ⅱa 活性之比适宜；③结构与肝素分级分离所得者结构基本相同；④无残留溶剂； ⑤工艺简单，成本低廉。
LMWH的制备方法大体上可分为物理分离法和化学裂解法或生物降解法，通常采用化学裂解法或生物降解法。由于制备方法不同得到的产品生物功能不完全相同，从而产生了LMWH的分级和欧洲药典2000年版及英国药典2002年版对不同分级的产品名称。
因此，无论是仿制或是研制不同分级的LMWH，应提供较为详尽的工艺文献资料和制备工艺的研究资料，以便从工艺过程控制保证终产品的质量。
三、结构确证：
LMWH的生物活性与其特异性结构密切相关。LMWH的结构复杂，组成LMWH的单糖多达10余种，各种单糖之间的连接方式不同导致LMWH具有不同的生物活性。在组成LMWH的各种单糖的糖环上有不同的取代基，包括硫酸基、乙酰基等，不同的取代基或者相同的取代基但取代的位置不同，均可导致LMWH具有不同的生物活性。不同方法制得的LMWH，结构差异的最大之处在于其末端结构。
目前，LMWH的抗凝活性和结构的关系并不清楚。因此，为了彻底了解LMWH的生物活性，必须了解LMWH的精确结构。在了解LMWH的精确结构的基础上，进一步探明LMWH的某种具体的特异性结构以及与之相对应的生物活性的关系具有重要意义。
但是由于组成LMWH的低聚糖链的复杂性，至今还没有完全明确其结构。欧洲药典对末端结构的测定通常采用的是LMWH的对照品核磁共振波谱检查，所得待测物的波谱应与对应的对照品一致。在现阶段，由于国内还没有更好的方法和仪器测定精确结构，核磁共振波谱检查还是较直观和科学的方法，建议采用。
四、质量标准
在LMWH质量标准中，分子量与分子量分布和抗Ⅹa因子与抗Ⅱa 因子活性测定是两个重要的质控指标。
除上述这两个重要的指标外，还应包括钠盐与钙盐的鉴别。检查项中应包括酸碱度、溶液的颜色、澄请度、干燥失重等常规检查；无菌、细菌内毒素等安全性检查：对杂质的控制应有重金属的限量检查，还应包括生产中引入的影响产品质量的杂质的检查，如核酸类杂质、杂蛋白、总氮含量的测定。另外为避免制备时水解条件过于剧烈，使肝素母链上硫酸根过度水解，需用电导法测定硫酸根与羧酸根离子的摩尔比。含量测定用生色底物法测定抗Ⅹa因子和抗Ⅱa 因子活性效价。表1中列出了BP收载的5种LMWH的部分质量控制项目和限度。

从表1看出，五种分级的LMWH其分子量与分子量分布和抗Ⅹa因子与抗Ⅱa 因子活性测定，以及硫酸化程度均有相似之处。这是由于每一种分级的LMWH的工艺使得低聚糖链的长短不均一，硫酸化的数目和位置不均一，分子量不均一，结构不均一，活性也不均一。每一分级中似乎还存在着分级。但考虑到低聚糖链的复杂性，以及肝素和LMWH已上市多年，其疗效和安全性基本能够保证。因此，在满足工艺与分级产品条件一致，验证分级产品与EP或BP对照品结构一致，以及质量研究和标准可控产品质量的条件下，基本可以认为产品具有了不同分级LMWH的特点。
五、稳定性
考虑到本品剂型的特点，动物来源的生化药常温不稳定，除一般要求外，还应包括热原和无菌等的考察。
以上的思考和建议为个人观点，仅供参考，有不妥之处欢迎大家提出意见讨论。

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