对神经保护剂治疗急性缺血性脑卒中药效学研究的考虑

审评八室王庆利

摘要：大量神经保护药物用于急性缺血性脑卒中治疗临床试验的失败，使人们认识到，一个新的神经保护剂在开始大型的、长时间的、昂贵的临床试验前，应进行严格的、全面的、详细的非临床评估，否则取得成功的可能性很小。非临床研究是评估神经保护剂治疗作用的重要方面，但目前尚无相关的指导原则。在1999年，在脑卒中治疗学术企业圆桌会议（Stroke Therapy Academic Industry Roundtable，STAIR(Stroke. 1999;30:2752-2758）上，由科研人员和企业代表共同讨论了神经保护剂非临床评估的相关问题，并为临床研究者提出了一些建议。本文主要参考该圆桌会议的情况，对神经保护剂治疗急性缺血性脑卒中药效学研究提出了一些想法，希望对国内研发有所参考。
关键词：神经保护，脑卒中，药效学

1、前言
脑卒中患者多为老年人，但目前45～65岁患者的发病率不断升高。有关局灶性脑缺血损伤病理生理的动物研究很多，但很少能转化为改善人脑卒中的有效措施。研究发现，脑卒中导致脑损伤的多种机制与缺氧有关，包括产生氧自由基、释放兴奋性氨基酸、释放炎症介质，有钙离子参与，能量代谢障碍以及其他机制。已有大量神经保护剂和保护策略研究，如自由基清除剂、兴奋性氨基酸拮抗剂、降温、巴比妥类药物、钙通道阻滞剂、生长因子等，但发现虽然很多神经保护剂在小动物缺血模型（大鼠、小鼠和沙土鼠）中显示很有效，而最终在人体试验中证明无效。例如，自由基清除剂替拉扎特（Tirilazad mesylate）在再灌注脑卒中模型中有效，但临床试验中对再灌注和非再灌注患者均无效。神经保护剂在动物模型中有效，而在人体中无效的确切机制尚不清楚，可能与药物本身或采用的动物模型的特异性有关。
2、给药剂量
在非人体脑损伤模型中有效的药物，在人体研究时却显示了明显的局限性。有些药物在低剂量时有效，而有些在高剂量时有效，也有些仅在中剂量范围内有效。在小鼠或大鼠中某一剂量有效，但可能在大动物和/或人体中无效。将小鼠的剂量仅通过mg/kg换算为大动物和人体的剂量可能是不合理的，或是错误的。
一些药物在某一剂量下显示有效或无效，但很多情况下不能得到剂量反应曲线。不同动物种属间药代动力学和药效动力学可能差别很大，因此，无论在小动物还是在大动物中获得剂量反应曲线是很关键的，应在几种动物中测定多种指标的剂量反应曲线。血脑屏障、脑血流量较低、血浆蛋白结合可能会影响人体剂量方案的确定。但是，在人体给药时应有一个目标浓度以提示临床试验中能否获得神经保护作用，该浓度是在动物试验中确定的有效组织浓度，或是一些替代指标。
3、时机窗
缺血事件发生后多长时间内开始给药的有效时机，即时机窗或治疗时间窗是研究的另一个关键问题。动物模型中的治疗时间窗不一定能预测人体情况，但测定相对时间窗是有用的，人体的时间窗可能不会明显长于小动物。先前研究发现，NMDA拮抗剂Cerestat 与Selfotel在动物模型中的时间窗很短，其在临床上无效可能与此有关。应在动物中确定最佳给药时间窗和治疗持续时间，以指导临床给药，研究发现有些神经保护策略在不同的给药起始时间及持续时间时出现相反的结果。
在动物模型中可以掌握脑卒中或缺血开始的确切时间，而在人体则不同。在动物模型中，通常是在缺血开始前或在再灌注时给药，而较少地关注在再灌注后不同的时间给药。但是对于人体来说，通常是在缺血发生数小时后才给药。这样，如果临床前动物试验显示，药物仅在动脉阻塞、再灌注时或其稍后给药才有效的话，这样的药物可能不太适合进行临床试验。因此，应评估缺血或再灌注开始后给药有效的时间窗，以确定药理学上有效的药物在缺血发生后何时给药才有临床效果。如在小动物或大动物模型中确定了在缺血开始后15分钟、1、2小时或更长时间给药有效的话，对临床研究则有重要的指导意义。
4、动物模型
动物局灶性缺血模型有多种，包括永久性和短暂性血管阻塞两种技术。通常，无论小动物还是大动物，首先进行永久性大脑中动脉结扎（Middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型研究，然后再进行短暂性（再灌注）模型研究。当然，作用机制研究提示仅在再灌后才可能有效的药物除外。通常短暂性模型的早期死亡率要高于永久性模型。与人类一样，在一些非人灵长类动物中，近端大脑中动脉永久性结扎的死亡率很高，在这种情况下，除非进行麻醉，永久性MCAO可能不合适。
应首先在大鼠中完成永久性和短暂性结扎模型研究，在大规模人体临床试验开始前可能还需要在猫或灵长类动物中进一步研究，对于那些新类型药物尤其如此。小鼠模型应仅采用转基因模型研究作用机制。大鼠和小鼠模型的另外一项特点是，某些品系对MCAO更敏感，能产生较大的梗塞体积，而其他种属却仅能产生较小的MCAO梗塞体积14。因此，在整个试验过程中应采用相同动物品系。
应避免使用沙土鼠（Gerbil）模型，因为许多药物在沙土鼠中有保护作用，而在其他种属中可能无效。
在动物模型中研究药物的神经保护作用时，应跟临床试验相同，采用随机和盲法。治疗的确切性是决定一个化合物能否进入临床开发的重要因素。有些实验室设计的缺血模型可能夸大了药物的神经保护作用，而有些实验室发现的半暗区或潜在的可补救区可能比其他实验室更真实。因此，神经保护剂应在2个或更多个实验室中进行研究，其中至少有1个实验室是独立于申办人之外的。
5 、生理指标监测
无论采用小动物或大动物，需要进行适当的生理指标监测以维持动物的适当状态，并可限制梗塞体积间的变异性。尽管在清醒动物中十分困难，但应尽可能监测血压、血气、血红蛋白、葡萄糖和脑血流量（Cerebral blood flow, CBF）等指标。脑温是一个需要监测的关键指标，在整个试验过程中应尽可能维持恒定。这可在大鼠中通过颞肌温度探针间接测量。CBF可通过多种技术来测量，小动物通常采用激光多普勒流量计（Laser Doppler flowmetry）。可在缺血前、缺血过程中、缺血后立即监测激光多普勒信号，信号的降低应达到≥60%以保证缺血达到合适的程度。
在大规模临床试验中，这些生理指标出现的较小不良改变，可能对临床试验结果产生重大影响，而这些改变在临床前小型药理学研究中可能不被重视。因此，在非临床研究中应考虑和重视不良事件和潜在的药物相互作用。
6 、结果评价
对于小动物和大动物模型，至少应考虑2种评价指标：功能反应和梗塞体积。结果评价可包括梗塞体积、免疫组化分析、神经病理学分析、躯体感觉诱发电位、脑电图分析、神经行为学指标。对结果的评价必须对急性期（1-3天）进行监测，如果要观察药物的长期作用，应进行长期监测（7-30天）。在永久性和暂时性结扎模型中，必须对急性期结果（通常为梗塞体积减小）进行评估，并观察药物治疗的改善作用，因为只有在急性治疗研究（通常全面监测6小时）中，才能从缺血开始对影响结果的所有生理性指标（血压、温度、葡萄糖）和临床指征（感染或血管炎症的指征）进行全面评估。许多临床前研究仅观察缺血开始24小时后的结果，目前研究显示有必要对动物跟踪观察更长的时间，确定初步显示的益处是否随时间延长而消失。对长期效果，即减少梗死面积，应进行评估以确定药物是否仅能减慢组织病理学过程。但是，在长期试验中连续检测生理指标存在较大的挑战。
7 、其他考虑
7.1 目标人群
没有一种动物模型可准确地模拟人脑卒中的情况，除非一种动物模型与人脑卒中具有相关性，否则将不能回答药物能否进入缺血组织以及药代动力学和时间窗的问题。所使用动物的年龄和种属也可能影响到该模型与人脑卒中的相关性。目前尚不确定对年轻、健康动物的益处是否可外延到老年病理状态的患者中。
7.2 脑卒中的性别差异
在开发神经保护药物时，重要的一点是要考虑性别差异对药物作用的影响。最近研究显示，在大鼠MCAO模型中，雌性大鼠的梗塞面积明显小于雄性大鼠，去卵巢大鼠的梗塞面积与雄性大鼠相似[23]。雌激素甚至黄体酮在该过程中起到了调节作用。研究显示给予外源性刺激性能减小雄性和雌性大鼠的梗塞面积，为减小梗塞面积和损伤的新治疗途径的发现提供了参考。因此，分别在雄性动物和雌性动物中观察神经保护作用来确定是否存在性别差异是重要的。目前至少在替拉扎特（tirilazad mesylate）的1项临床试验中显示了脑卒中治疗方面存在性别差异，可能是由男性和女性代谢差异所致。

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